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食用菌液体菌种的几种实用 检测方法

2015-04-05 19:03:00       评论:0
[摘要]由于液体菌种具有生产周期短,菌龄一致,菌种成本低,接种简便,便于管理,易于实现工业化、标准化生产的优点,目前越来越多的人在研究和使用液体菌种。然而,在液体菌种的生产过程中,对培养情况及时做出判断,
由于液体菌种具有生产周期短,菌龄一致,菌种成本低,接种简便,便于管理,易于实现工业化、标准化生产的优点,目前越来越多的人在研究和使用液体菌种。然而,在液体菌种的生产过程中,对培养情况及时做出判断,对污染的检测并恰当的安排生产是液体发酵的关键技术之一。现介绍几种实用的污染检查方法及常见指标的检测方法。
 1.培养液气味检查菌种培养正常, 在发酵排气处可闻到一股菇香或培养液原先的气味,在发酵后期,气味可能会略带酸味。这是由于菌种培养前期,因菌液中含有大量单、多糖类营养物质,因而糖香味很浓,随着营养被利用,菌液的糖香味越来越淡,取而代之的是或有或无的菌丝特有的芳香气。若有杂菌污染,发酵12h后可闻到甜、霉臭、酒精等异味。
2.菌液澄清度及颜色变化因培养基中含有大量颗粒状及大分子的营养物质,在培养前期菌液稍显浑浊,随着培养时间的延长,营养物质逐渐被利用,菌液变得越来越澄清,而染细菌、放线菌、酵母菌的菌液则很浑浊;因菌液中加入红糖等营养物质,灭菌后溶液呈浅茶红色,随着营养被利用,溶液颜色越来越淡,多数呈淡黄色或橙黄色,但有些品种比较特殊,如:黑木耳呈青褐色,蜜环菌呈浅棕色。 
3.显微镜检查在发酵过程中定时(间隔6-8h或12h)用接种环取2-3环发酵液涂片,制成临时玻片,显微镜观察,如发现异常菌体或菌体碎片等就说明已经污染。另外,在玻片上观察到锁状联合为最佳的状态,是最好的接种时间,据此可推算培养时间、PH下降情况、菌球数量等数据。染色镜检,可检查本菌的着色情况,着色深,菌新鲜,生长力强,并可观察菌丝分裂繁殖情况。如看到空泡及胞壁、胞浆颗粒等,则此菌衰退,生长力也较弱。显微镜检查方法简便,速度快,能及时发现杂菌,不足之处,由于取样少,视野观察面小,不易检查出少量的杂菌。 
4.划线培养检查一般是将样品直接在培养基上划线培养(28-30C),也可先经肉汤培养基之后再进行划线培养。划线法反应结果较慢,操作复杂,但能检查出少量污染菌。
5.肉汤培养检查取发酵液1环接种于酚红肉汤试管中, 置28-30C中培养,如溶液由红变黄,表明发酵液中染有细菌;如溶液红色不变,则无细菌生长。细菌酚红肉汤培养基配方:蛋白胨1%,葡萄糖0.3%,牛肉膏0.3%,氯化钠0.5%,酚红0.003%.(酚红先配成1%酒精溶液备用),PH7.4-7.5, ,120C灭菌30分钟。6作纯种试验将菌球液接种到液体、 斜面固体培养基上共4支,其中,1支斜面固体、1支液体,PH为7.2-7.4,置37C下观察3D,判定结果:如液体污染杂菌,会散发出异味;固体斜面污染杂菌,可见表面生长菌落或菌苔(菌落成片称菌苔)。 另1支斜面及液体PH为3.0-6.5,置温度26C下7-9D后观察,判定结果:液体有异味即为有杂菌;斜面也可看到带色的(绿、黑、黄、红色)霉菌为污染,已污染的杂菌的培养液应废弃,如无污染,则可观察本菌生长及萌发情况,液体及固体在表面均可见发白色菌丝生长。 
7.菌丝体形态观察在深层培养的早期和中期, 菌丝粗壮,分枝较少,原生质体嗜碱性强,着色深,有些菌种的菌丝有横隔,有锁状联合;而后期菌丝变细,并有大量分枝产生,原生质体嗜碱性弱,色浅,出现较多空泡,此时菌丝通常不再出现横隔或锁状联合,或仅有少量存在,这是菌丝衰老的特征,应提前放罐。在深层培养过程中菌丝常常疏松紧密地集合在一起,成网状,肉眼观察即为菌球。菌球中空时表明其中菌丝已老化,部分菌丝自溶。有的菌丝在深层培养之中呈絮状。菌球表面有或无毛刺,有毛刺说明生长旺盛;毛刺消失,菌球光滑,表明开始老化。菌球颜色由浅变深,也表明老化。在正常培养中,80%菌球直径要小于2mm。培养终止时菌球浓度一般达到(1000-1500)个/ml。
8.菌丝(球)的浓度状态菌种接入液体培养中24h后,会发现接入的菌种颗粒周边萌发长出白色菌丝,当菌丝长到一定时期会断落到菌液中成为新的萌发点而产生新的菌球,到40-60h,会发现菌液中有大量的菌丝片段。在60-80h一般菌球达到最大浓度(80%-100%.),取样静置菌液基本不分层,料液的粘度高,菌丝(球)悬浮力好,菌球大小均匀、界线分明、活力强,而老化的菌种菌液颜色会逐渐变深,菌球轮廓不清,甚至自溶成为一体粘糊的粥状物。
9.菌丝量测定量取一定体积的培养液,经3000r/min离心10min,倾弃上清液,称菌泥质量。这种方法的准确性依培养液营养组成而定,若培养液组成都是可溶性的,那么测定结果是准确的;若营养组分是部分溶解性的,如麸皮、黄豆粉等,则测定结果偏高。因此,还可用过滤法测菌丝体干重,根据菌丝球的大小,选用适当筛子过滤,洗涤,滤得的菌丝体应达10g/L或菌泥在20-25g/L
10.酸碱度测定 不同种类的食用菌,都有一个最适酸碱度,在适宜的酸碱度环境中,菌丝生长最快。PH值过低,对菌丝球大小、形态、活力均有影响。另外,在有异常发酵时,PH值也会有明显的变化。因此,发酵过程中要不断检测发酵液的酸碱度,并进行调整。一般的发酵罐都备有酸碱度调整孔口,通过孔口向罐内添加酸液或碱液,调节培养液的PH值。一般发酵终止时PH值在5.0左右。
11.含糖量测定包括总糖和还原糖的测定。在培养过程中,总糖含量是不断下降的,但下降的速度与培养的进程有关。最初一段时间里总糖下降不明显;中期菌丝大量生长繁殖,降解利用基质,总糖含量迅速下降;后期由于代谢产物积累,营养消耗,菌丝生长缓慢,总糖含量保持在一定水平。 在培养过程中,还原糖的变化与总糖变化相似,亦分3个阶段。初期,还原糖下降缓慢;中期,还原糖含量下降迅速;后期,还原糖下降又缓慢下来,有些易发生自溶的菌类,其还原糖还会出现回升现象。培养终止时,残糖量应小于1.2%。
12.氨基酸的测定  食用菌菌丝在生长过程中,释放胞外蛋白酶,降解基质中的蛋白质,产生氨基酸或短肽,一部分被菌丝吸收利用,另一部分积累在培养液中。初期,氨基酸含量缓慢上升;中期,菌丝大量生长繁殖,分泌大量胞外蛋白酶,使氨基酸含量迅速增加;末期,氨基酸的含量又处于缓慢状态。放罐标准氨基酸含量不超过30mg/ml为宜。
13.多糖含量测定  多糖含量的测定常用苯酚-硫酸法。其机理是首先利用硫酸将多糖水解成单糖,单糖进一步脱水生成糖醛或糖醛的衍生物,这些物质再和苯酚反应生成有色化合物,有色化合物的颜色和多糖的含量成正比,颜色的深浅可用分光光度计于490nm处测得。多糖的含量还可用地衣酚-硫酸法或蒽酮-硫酸法等进行测定,原理与上述相同。
14 酶活性的测定  食用菌在液体深层培养过程中,菌丝体可分泌多种酶类,如常见的有淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、漆酶、果胶酶等。其活性变化规律,因培养基组成、食用菌种类、培养条件等的不同而异。酶活能否作为液体发酵的指标,以及哪些酶活能作为液体发酵的指标,不能一概而论。如对金针菇液体发酵培养过程中发酵液的蛋白酶、纤维素酶和漆酶活性的变化进行分析,结果表明3种酶活性的变化趋势基本一致。培养初期为菌丝的缓慢生长期,酶活性较低,其后菌丝开始迅速增殖,从而分泌出大量的酶,基质分解速度加快,酶活性增大;培养6d后,酶活性不再增加,基本上保持不变;培养后期,菌丝逐渐进入衰退期,酶活性也呈下降趋势。可见,金针菇菌丝体酶活性的变化与其生长趋势基本一致,可以作为金针菇液体菌种生产的控制指标。 以上的检测方法,菇农可根据自己的实际情况选择合适的方法,而避免人力、物力的浪费,为提高菇农的经济效益提供有利的条件。
 

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